四方藤小复方的作用机制及对类风湿性关节炎大鼠的抗炎作用研究

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摘要:目的研究瑶药四方藤小复方对类风湿性关节炎(RA)大鼠的抗炎作用,并分析四方藤小复方的作用机制,预测其质量标志物(Q-marker)。最好的最好的辦法 SD大鼠随机分为对照组、模型组、雷公藤多苷片阳性对照组以及四方藤小复方提取物高、低剂量(28.7、7.2 g/kg)组,每组8只。除对照组外,其余各组均采用II型胶原蛋白-完全弗氏佐剂法诱导RA大鼠模型,各给药组在造模期间ig给予相应药物,连续28 d。实验期间观察大鼠足趾红肿程度并评分,实验末采用ELISA法测定血清白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平。通过TCMSP和Drugbank数据库搜索并筛选四方藤小复方的化学成分以及预测作用靶点,采用TTD数据库搜索RA疾病靶点。通过String数据库和Cytoscape软件构建和可视化靶点互作网络,通过MCODE插件聚类分析。利用String数据库进行GO和KEGG富集分析。最后结合化学成分的有效性、可测性,预测四方藤小复方的Q-marker。结果与模型组比较,四方藤小复方提取物高、低剂量组及雷公藤多苷片组大鼠足肿胀程度明显减轻(P<0.01),血清IL-1β和TNF-α水平均显著降低(P<0.01)。RA的疾病靶点有89个,发病机制与细胞因子-受体作用通路、RA通路异常有关。四方藤小复方中筛选得到3有有一个多 化学成分、化学成分的作用靶点119个,其中1有有一个多 属于疾病靶点,参与刺激反应调节、细胞增殖调节、细胞代谢过程调节、细胞内信号转导的调控等1 11有有一个多 生物学过程,以及调控RA通路、TNF通路等113条信号通路,最终发挥治疗RA的作用。同時 预测得到岩白菜素、白藜芦醇、氯化两面针碱、蛇床子素、芳樟醇、欧前胡素、乙氧基白屈菜红碱、芹菜素、黄连碱、橙皮苷、芝麻素1有有一个多 成分可作为四方藤小复方的Q-marker。结论四方藤小复方可显著减轻RA大鼠的急性炎症,其原因分析分析通过白藜芦醇等多种成分作用于以PTGS2为主的多个靶点,参与调控RA通路、TNF通路等多条炎症免疫通路。岩白菜素、白藜芦醇、氯化两面针碱、蛇床子素、芳樟醇、欧前胡素、乙氧基白屈菜红碱、芹菜素、黄连碱、橙皮苷、芝麻素可作为用于四方藤小复方质量控制的Q-marker。

类风湿性关节炎(RA)是你你你这个 常见的以关节滑膜慢性炎症及系统性血管炎为社会形态的慢性自身免疫功能障碍性疾病[1],其发病机制复杂,与免疫失调、遗传因素、环境有关[2-4]。四方藤小复方是广西大瑶山区瑶族人民在瑶医药理论指导下治疗风湿痹痛常用瑶药验方中挖掘得到的由瑶药四方藤、买麻藤、两面针跟生药独活、千年健组成的小复方。为更好开发瑶医药资源,本课题组对该方进行深入研究,拟开发成具有抗RA作用、质量可控的医疗机构制剂。

本课题组前期对该复方中四方藤单味药材进行研究,证实四方藤对RA大鼠具有显著治疗作用,其机制原因分析分析与下调滑膜组织中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、核转录因子-κB(NF-κB)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)的表达有关[5],本研究进一步考察四方藤小复方对RA大鼠的抗炎作用,并借助网络药理学技术分析RA的靶点,揭示RA的发病机制,分析四方藤小复方的主要作用成分、作用靶点和作用通路,揭示四方藤小复方的多成分、多靶点、多通路的作用机制,并预测四方藤小复方的质量标志物(Q-marker),为四方藤小复方质量控制提供参考与最好的最好的辦法 。

1材料

1.1仪器

EL104型电子分析天平(梅特勒公司);Infinite 1000 PRO多功能酶标仪(瑞士TECAN公司);−1000℃超低温冰箱(中国美菱低温科技有限责任公司);冷冻高速离心机(赛默飞世尔有限公司)。

1.2药品与试剂

雷公藤多苷片(浙江得恩德制药有限公司,批号110009126B);完全弗氏佐剂(Sigma公司);白细胞介素-1β(IL-1β)、TNF-α酶联免疫吸附测定试剂盒(南京建成生物工程研究所);牛II型胶原蛋白(Sigma公司,批号C710006);四方藤小复方提取物(广西中医药大学中药制剂共性技术研发重点实验室提供);四方藤、买麻藤、两面针、独活、千年健药材均购自南宁市万药堂药业有限公司,由广西中医药大学韦松基教授鉴定四方藤为红心红提 科植物翼茎白粉藤Cissus pterocladaHayata的干燥藤茎、买麻藤为买麻藤科植物买麻藤GnetummontanumMarkgr.的干燥藤茎、两面针为芸香科植物两面针Zanthoxylum nitidum(Roxb.)DC.的干燥根、独活为伞形科植物重齿毛当归Angelicapubescens Maxim.f.biserrata Shan et Yuan的干燥根,千年健为天南星科植物千年健Homalomena occulta(Lour.)Schott的干燥根茎。

1.3软件及数据库

TTD数据库(http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/)、Drugbank数据库(version 5.1.1,https://www.drugbank.ca/)、TCMSP数据库(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)、UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)、String数据库(version 10.5,https://string-db.org/)、Cytoscape(version 3.7.1)。

1.4动物

SD大鼠,SPF级,雄性,体质量120~1000 g,购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司,动物许可证号SCXK(湘)2016-0002。

2最好的最好的辦法 与结果

2.1四方藤小复方提取物对RA大鼠的急性炎症的作用

2.1.1四方藤小复方提取物的制备称取四方藤10000 g、买麻藤1000 g、两面针1000 g、千年健1000 g、独活1000 g,煎煮3次,每次加8倍水、0.5 h,滤过,合并滤液,减压浓缩成每毫升大约生药1.4 g的清膏,4℃保存备用。经HPLC法测定,清膏中含岩白菜素7.22mg/g。

2.1.2动物模型制备、分组和给药取40只SD大鼠适应性喂养3 d后,随机分为对照组、模型组、雷公藤多苷片阳性药组(1.5 mg/kg)和四方藤小复方提取物组(根据该方临床单日用量1000 g为标准,按大鼠与人等效剂量换算,选取四方藤小复方提取物高、低剂量分别为大鼠与人等效剂量的4、1倍,即四方藤小复方提取物高、低剂量折合成生药的给药剂量分别为28.7、7.2 g/kg)。除对照组外,其余各组大鼠均于第1天右后足掌皮内注射II型胶原蛋白-完全弗氏佐剂乳剂0.1 mL进行初次免疫,第五天尾根部再次注射同剂量造模剂加强免疫,建立RA大鼠模型。自造模第1天起,雷公藤多苷组和四方藤小复方提取物高、低剂量组分别ig给予相应药物,对照组和模型组ig给予等体积生理盐水,1次/d,连续28 d。

2.1.3大鼠关节病变程度评分采用关节炎评分法(4级评分法)[5-6]。0分:无红肿;1分:足小趾关节红肿;2分:趾关节、足趾均红肿;3分:跖关节以下均红肿;4分:包括跖关节,完全红肿。每有有一个多 足趾关节最高评分为4分,累计四肢关节评分最高为16分。每五天评分1次,到28 d为止。结果显示,从致炎第8天刚开使,各组大鼠足部均经常再次出现不同程度的肿胀,模型组在致炎第20天炎症反应最为严重,大鼠跖关节完全红肿并经常再次出现溃烂。第28天,与模型组比较,四方藤小复方提取物组、雷公藤多苷组大鼠足部红肿症状得到明显改善。关节病变程度评分-时间曲线图见图1。

2.1.4血清IL-1β、TNF-α水平的测定在末次给药1 h后,腹主动脉取血5 mL,分取血清,按试剂盒说明测定血清中IL-1β、TNF-α的水平。与对照组比较,模型组大鼠血清IL-1β、TNF-α的水平显著升高(P<0.01),说明模型大鼠经常再次出现急性炎症;与模型组比较,四方藤小复方提取物高、低剂量组和雷公藤多苷组大鼠血清中IL-1β和TNF-α的水平明显下降(P<0.01),结果见表1。

2.2四方藤小复方提取物对RA大鼠作用机制的网络药理学分析

2.2.1化学成分及其靶点的埋点和筛选通过文献检索和查询TCMSP数据库搜索处方中药材的化学成分,以口服生物利用度(OB)≥1000%且类药性(DL)≥0.18为标准筛选得到的化学成分以及文献报道有活性的化合物作为四方藤小复方提取物的化学成分。并且通过TCMSP数据库和Drugbank数据库查询四方藤小复方提取物化学成分对应的靶点,删除重复靶点,经UniProt数据库标准化靶点名称。本研究共筛选出7个OB≥1000%且DL≥0.18的化学成分,打上去通过文献报道[7-10]筛选得到2有有一个多 活性成分(表2),共3有有一个多 化学成分可作用于119个靶点。

2.2.2 RA疾病靶点及发病机制分析以“rheumatoid arthritis”为关键词检索TTD数据库,共得到89个RA疾病靶点。GO分析显示,RA涉及细胞因子调控、免疫反应、多细胞组织过程的正调控等81有有一个多 生物学过程,涉及细胞因子受体结合、细胞因子活性、信号受体活性等3有有一个多 分子功能,与膜侧、细胞外间隙、细胞冠部 等19个条目相关。KEGG富集分析,显示RA与细胞因子-受体作用通路、RA通路、破骨细胞化通路等78条通路相关。

2.2.3“药材-化学成分-作用靶点”网络构建及药物作用机制分析为了更好地寻找化学成分靶点、疾病靶点的相互作用关系,将它们导入String数据库获得靶点间的作用关系,将该作用关系导入Cytoscape软件建立靶点互作网络图,并通过Cytoscape自带MCODE插件进行聚类分析(K-Core=2,许多参数为默认值),筛选靶点互作网络中关键的靶点集(亦即核心化学成分靶点、核心疾病靶点)。本研究对119个化学成分靶点、89个疾病靶点进行分析,重复靶点有1有有一个多 ,亦即药物时要直接作用于1有有一个多 疾病靶点。将196个靶点导入String,去除无相互作用的靶点,得到由19有有一个多 节点、2 491条边组成的网络(网络密度为0.10009,平均节点度为26.1)。将该网络经聚类分析,提取得到有有一个多 中含7有有一个多 靶点的与RA密切相关的网络(1 452条边,网络密度为0.766,平均节点度为39.2),其中核心化学成分靶点4有有一个多 、核心疾病靶点4有有一个多 ,其中同時 靶点1有有一个多 ,见图2。取该网络进行GO富集分析显示,四方藤小复方中化学成分主要影响刺激反应调节、细胞增殖调节、细胞代谢过程调节、细胞内信号转导的调控等1 11有有一个多 生物学过程,调节蛋白/受体/酶/细胞因子/生长因子的结合、MAP激酶活性、信号受体活性等5有有一个多 分子功能,并与细胞质膜、细胞间隙、细胞组分等2二个细胞组成有关。KEGG富集分析显示,四方藤小复方中化学成分调控113条信号通路,排名靠前的通路是细胞因子-细胞因子-受体相互作用通路、RA通路、TNF信号通路等,见图3(Y轴代表通路名称,X轴代表富集因子,气泡面积大小代表目标基因集中属于你你你这个 通路的基因数量,气泡颜色代表富集显著性,即P值的大小)。

进一步通过Cytoscape构建“药材-化学成分-作用靶点”网络图(图4,三角形代表药材,四边形代表化学成分,圆形代表化学成分靶点),网络中节点越大表示度值(degree值)越大,说明与其连接的节点太多,提示该节点在RA治疗中的重要性越大。由图4可见,买麻藤有二个化学成分作用于3二个关键靶点,四方藤有有有一个多 化学成分作用于26个关键靶点,两面针有9个化学成分作用于9个关键靶点,独活有6个化学成分作用于有有一个多 关键靶点,千年健有有有一个多 化学成分作用于二个关键靶点,提示药材的重要性排序为买麻藤>四方藤>两面针>独活>千年健。四方藤小复方中2有有一个多 化学成分与治疗药Q-marker具有可测性、有效性、特有性、传递与溯源性、处方配伍二个基本社会形态,本研究以化学成分的可测性和有效性为最好的最好的辦法 ,从2有有一个多 潜在Q-marker中进一步筛选。

根据潜在Q-marker的有效性进行筛选。网络药理学分析得到24种化学成分均可作用于RA相关靶点,通太多成分-多靶点-多通路发挥治疗RA的作用,这与文献关于白藜芦醇、芹菜素、两面针生物碱、欧前胡素、蛇床子素、芳樟醇具有多种有益于治疗RA的药效活性的报道一致[9,13-17],并且银松素、葫芦巴碱等节点度低,可考虑去除。

根据潜在Q-marker的可测性进行筛选。除银松素、异丹叶大黄素、异紫花前胡苷、异紫花前胡内酯、木兰花碱5种成分因这么对照品无法定量外,其余成分均时要作为四方藤小复方的Q-marker,其中岩白菜素、氯化两面针碱、蛇床子素、芳樟醇分别是四方藤、两面针、独活、千年健药材的指标成分[18],白藜芦醇、欧前胡素、乙氧基白屈菜红碱是相应药材中含量较高的可测性成分[19-21]。综合考虑Q-marker的有效性、可测性[22-24]以及成分的丰度,打上去degree值靠后的以及无法定量的成分后,本研究将岩白菜素、白藜芦醇、氯化两面针碱、蛇床子素、芳樟醇、欧前胡素、乙氧基白屈菜红碱、芹菜素、黄连碱、橙皮苷、芝麻素共1有有一个多 化学成分作为四方藤小复方治疗RA的Q-marker。

3讨论

3.1四方藤小复方的主要作用靶点是PTGS2

RA中IL-1β、IL-6和TNF-α有益于小分子炎症介质的释放,抑制各种生长因子对软骨细胞的促有丝分裂作用,最终原因分析分析软骨破坏。IL-10是促炎细胞因子的负调节因子,可减少促炎细胞因子释放[25]。TNF-α是RA病理生理学的核心细胞因子,具有促炎作用,它在RA中的关键作用已通过用TNF抑制剂治疗RA患者的临床试验结果得到证实[26]。JUN与成骨细胞增殖和破骨细胞的分化、心智心智成熟期期 是什么是什么 的句子是什么是什么期期及功能密切相关,对骨形成和骨吸收的动态平衡的维持有重要作用。趋化因子CCL2则通过使炎性细胞迁移至病变的关节滑膜而参与RA的病态形成过程。MMPs是一组蛋白水解酶家族,被激活的MMPs会引起细胞外基质的降解原因分析分析组织破坏,炎症、肿瘤的浸润、转移、血管新生以及许多炎症反应,证确实 RA大鼠滑膜组织中MMP-1、MMP-2、MMP-9等MMPs家族含量较高[27-28]。PTGS2即环氧合酶(COX-2),是前列腺素合成的主要限速酶,可被多种炎性介质及细胞因子诱导大量表达,参与组织炎症过程及细胞的分化增殖过程。本研究结果证实四方藤小复方提取物降低RA大鼠血清IL-1β和TNF-α水平,网络药理学预测四方藤小复方中主次已知的化学成分可作用于MAPK1、MAPK3、MAPK8、IL1B、IL2、IL6、IL10、TNF、VEGFA、PTGS2、CCL2、JUN、MMP1、MMP2、MMP9等7有有一个多 靶点。值得注意的是,四方藤小复方中2有有一个多 关键药效成分中含2二个成分作用于PTGS2,是众多靶点中最重要的有有一个多 。综合上述,提示四方藤小复方中的化学成分可作用于PTGS2为主的多个靶点,有益于减少前列腺素的生成,控制关节炎症的发展和关节的破坏[29],你你你这个 点在RA大鼠血清IL-1β、TNF-α水平得到了验证。

3.2四方藤小复方原因分析分析通过调控RA通路、TNF通路缓解RA炎症

RA通路中含T细胞受体信号通路、Toll受体信号通路、VEGF信号通路及破骨细胞分化和Th17细胞分化均与调节免疫和炎症相关。其中,T细胞介导的免疫反应异常是RA的主要发病机制,在病变的滑膜组织中,血管附进聚集着大量激活情形的T淋巴细胞,活化的T淋巴细胞与滑膜巨噬细胞直接作用,分泌细胞因子,刺激滑膜细胞释放胶原酶和蛋白酶,造成软骨和骨损害;Toll受体信号通路在识别病原微生物的基础上直接触发胞内杀菌机制原因分析分析诱导免疫炎性因子产生以扩大非特异性防御,研究提示RA患者病变组织中Toll受体表达增加[1000];滑膜炎中最早观察到的什么的间题之一是新生血管形成,VEGF是参与调控血管新生的关键分子,血管生成时要有益于炎性细胞渗入关节原因分析分析滑膜增生和进行性骨破坏[31];VEGF信号通路在关节炎中抑制细胞因子的表达,减少胶原蛋白的产生、抑制滑膜细胞增殖、减弱侵袭能力等。此外,RA的指在和发展与TNF信号通路中IL6、IL1B、TNF和PTGS2的异常表达有关。从本研究结果可见,四方藤小复方参与调控的主要的信号通路有细胞因子-细胞因子受体相互作用通路、RA通路、TNF通路等,其中以炎症信号通路为主,提示四方藤小复方通过炎症通路缓解RA。

3.3岩白菜素、白藜芦醇等11种化合物可作为四方藤小复方的Q-marker

中药复方具有多成分、多途径、多靶点协同作用的特点,中药整体性作用的社会形态使得中药复方的作用机制、药效成分尚不清楚,中药制剂质量难以准确评价、控制。中药Q-marker是指在于中药材、饮片、提取物以及中药制剂中的与功效密切有关的成分,是时要溯源、定性和定量的关键药效物质[32]。网络药理学技术的发展,便于研究者更有效地通过复杂的“中药成分-疾病”网络,筛选出治疗疾病的核心药效成分,阐明复方的作用机制,同時 也能通过成分关联药效,预测Q-marker。白藜芦醇属于多酚类物质,是买麻藤和四方藤共有成分,也能减缓炎症因子对关节滑膜的侵害、抑制滑膜细胞增殖、有益于滑膜细胞凋亡、保护骨和关节软骨,也具有抗氧化和免疫抑制作用[33]。买麻藤中芹菜素除抗炎、抗氧化作用外还能调节Th1与Th2细胞之间的动态平衡[34],维持机体正常的免疫功能。两面针生物碱类的抗炎、抗肿瘤效果显著,与两面针活血化瘀、解毒消肿相关[35]。香豆素类则是独活治疗RA的药效物质基础,比如欧前胡素通过抑制炎症因子和影响外周的致痛因子发挥抗炎镇痛作用[36],异紫花前胡内酯可下调COX-2[37],蛇床子素具有调节免疫系统作用[20]。芳樟醇是千年健挥发性油成分之一,具有抗炎、镇痛、抗肿瘤作用[38],与其祛风湿、壮筋骨相关。本研究从Q-marker的有效性、可测性以及成分的丰度,打上去degree值靠后的以及无法定量的成分后,得到1有有一个多 化学成分可作为四方藤小复方治疗RA的Q-marker,是合理的,并且时要进一步开展11种Q-marker的相关验证研究。

RA为慢性炎性自身免疫性疾病,发病机制复杂。本研究结果提示该病与多靶点、RA通路为主的多信号通路异常有关,发病机制具有多靶点、多通路的特点。在一定程度上解释了临床上针对疾病单一靶点的治疗无良好效果的什么的间题。中药治疗疾病则具有多成分、多靶点、多通路的作用特点与优势,在中药中寻找治疗RA的药物是研究热点。在中药复方的质量控制方面,进行合理、准确的质量控制是难点。本研究发现四方藤小复方具有良好的减轻RA炎症水平的作用,采用网络药理学技术发现,四方藤小复方原因分析分析是通过白藜芦醇等24种化学成分,作用于PTGS2为主的89个靶点,通过调节RA通路、TNF通路,减少IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎因子的释放,提高内源性抗炎物质的产生,抑制基质金属蛋白酶、蛋白激酶和趋化因子的表达从而限制炎症损伤,调节组织修复。同時 ,还预测了岩白菜素、白藜芦醇等11种成分可作为四方藤小复方的Q-marker。本研究结果体现了四方藤小复方治疗RA的多成分、多靶点、多通路的作用机制与优势,并为四方藤小复方的质量控制及新药开发提供了最好的最好的辦法 。

参考文献(略)

来源:梁健钦,严炯艺,冯茵怡,黎芳,谢谭芳,奉建芳,方雪湾.瑶药四方藤小复方对类风湿性关节炎大鼠的作用及机制研究和Q-marker预测[J].中草药,2019,1000(19):4705-4712.

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